您现在的位置:首页 / 长期应用恩替卡韦治疗的慢性乙型肝炎患者耐药发生情况及原因分析:8年随访研究
长期应用恩替卡韦治疗的慢性乙型肝炎患者耐药发生情况及原因分析:8年随访研究
来源:

[*]通信作者:蔡晧东,女,主任医师,Tel:(010)84322194,E-mail:chddt@163.com
     乙型肝炎是危害全球人民健康的严重问题。据世界卫生组织(WHO)估计,全球大约有3.5亿人为乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染者,且每年约有100万人死于HBV感染所致肝硬化、肝衰竭和原发性肝细胞癌(HCC)[1]。慢性乙型肝炎治疗的总体目标是最大限度地长期抑制HBV,减轻肝细胞炎症坏死及肝纤维化,延缓和减少肝脏失代偿、肝硬化、 HCC及其并发症的发生,从而改善患者生活质量,延长其存活时间[2]。近年来核苷(酸)类抗HBV药物的发展为慢性乙型肝炎的治疗带来了希望。目前我国已有4种该类药物上市,即拉米夫定(lamivudine, LAM)、阿德福韦酯(adefovir dipivoxil,ADF)、恩替卡韦(entecavir,ETV)和替比夫定(telbivudine,LdT)。但是,这些药物都需要长期应用,均有发生耐药的风险。2002年以来,北京地坛医院参与了多项ETV治疗慢性乙型肝炎的随机对照试验,包括ETV剂量和疗效的随机双盲Ⅱ期临床试验(ETV-012,2002-2003)[3-4]、 ETV与LAM治疗慢性乙型肝炎的随机双盲对照Ⅲ期临床试验(ETV-023,2003-2006)[5-6]、ETV治疗LAM失效的慢性乙型肝炎Ⅲ期临床试验(ETV-056,2003-2005)[7]及其后续ETV开放治疗临床试验(ETV-050,2005-2007)[8]。其后我们对我院参与上述临床试验、应用ETV治疗的患者继续进行治疗随访研究,观察耐药发生情况并对耐药患者进行了HBV DNA多聚酶基因逆转录酶区(RT)序列突变检测,对耐药原因进行了分析探讨。
     1 对象与方法
     1.1 对象
     2002-2007年本院参加ETV-012、ETV-023、ETV-056和ETV-050临床试验的患者,共63例(图1)。3例为参加ETV-012研究的患者,应用ETV治疗48周、停药后丙氨酸转氨酶(ALT)及HBV DNA反弹,加入ETV-050研究。32例为参加ETV-023研究的患者,ETV初始治疗组15例,其中10例96周后加入ETV-050研究;LAM初始治疗组18例,其中17例于48~96周加入ETV-050研究。28例为参加 ETV-056研究的患者,治疗48周试验结束后均加入ETV-050研究。
     63例中男性58例(92.1%),女性5例(7.9%);患者进入ETV-012、ETV-023、ETV-056研究时年龄17~50岁,平均(30±7)岁,中位年龄44岁。17例(26.9%)有明确的HBV感染家族史。治疗前乙型肝炎e抗原(HBeAg)阳性者56例(88.9%),HBeAg阴性7例(11.1%)。所有患者ALT均高于1.3倍正常值上限,平均ALT水平为(213±130)U/L;除 ETV-023研究中LAM初始治疗组患者外,其他患者在ETV治疗前HBV DNA均>6log10拷贝/ml(7.3~9.9log10拷贝/ml,中位数9.0log10拷贝/ml)。
    
     注ETV:恩替卡韦,LAM:拉米夫定
     图1 纳入本研究的慢性乙型肝炎患者来源及其治疗随访情况
     Fig 1 The Source of chronic hepatitis B patients who were enrolled in this study and the situation of their therapy and follow-up
     1.2 随访方法
     患者每3个月到门诊随访1次,进行肝功能 HBV DNA等检查和依从性问诊随访。本研究所涉及的临床耐药定义为:连续2次检测HBV DNA较治疗期间最低值升高>2log10拷贝/ml,且排除依从性差(服药率<90%)、停药等原因。
     纳入本研究累积耐药率计算的最后一次随访时间为2011年3月。
     对依从性差的患者进行相关教育,让他们继续服药治疗。在随访3.5~4和7~8年时,分别对临床耐药患者进行HBV RT序列突变检测。
     1.3 实验室检查
     在ETV-012、ETV-023、ETV-056和ETV-050研究中,血清ALT和HBV DNA检查均在北京美迪生药业研究有限公司的中心实验室完成。血清HBV DNA采用定量聚合酶链反应(PCR)法,检测试剂由罗氏诊断实验室提供,最低检测值为300拷贝/ml。在后续的ETV-050试验结束后(治疗3.5~4年),所有检查均在北京地坛医院检验科完成。HBV DNA采用实时荧光定量PCR法,第3.5~5年使用深圳匹基生物有限公司的HBV-DNA实时荧光定量 PCR扩增试剂,第5年以后使用上海科华生物有限公司的HBV-DNA实时荧光定量PCR扩增试剂,最低检测值均<500拷贝/ml。HBV RT序列突变检测使用PCR产物直接测序法[9]。
     1.4 耐药原因分析
     分析指标为临床耐药患者的初治药物、LAM耐药状况、治疗前HBV DNA水平、治疗6个月HBV DNA应答状况和治疗依从性。
     1.5 统计方法
     采用Stata 10统计软件进行数据统计分析。累积耐药发生率采用Kaplan-Meier生存分析法计算[10]。率的比较采用χ[2]检验或Fisher精确概率法, P<0.05为差异有统计学意义。
     2 结果
     2.1 随访情况
     63例患者在治疗随访期间的流动情况见图1。3例在治疗2年后失访。1例治疗2.5年时转其他中心治疗。59例患者接受长期治疗,其中16例用药4~6年,43例用药7~8年;随访4~8年,中位随访时间7年。
     2.2 耐药发生情况
     63例患者按照其初始治疗药物分为ETV初治组(ETV组)和LAM经治组(LAM-ETV组)(图1)。 ETV组18例,其中2例失访;1例转其他中心治疗;3例符合标准停药,随访0.5~3年未复发;2例分别于治疗5.5和7.5年时发生病毒学反弹,考虑临床耐药;10例保持病毒学应答。LAM-ETV组45例,其中1例失访;3例符合标准停药,随访1.5~2年未复发;11例在治疗4~8年时发生病毒学反弹,考虑临床耐药;5例自动停药;25例保持病毒学应答。临床耐药的发生时间、例数及累积耐药发生率见表1。
     表1 慢性乙型肝炎患者恩替卡韦长期治疗期间临床耐药的发生情况
     Tab 1 Clinical resistance occurring in chronic hepatitis B patients during long-term entecavir treatment
    
     从表1中可以看出,在ETV治疗的第1~2年无一例患者发生耐药,治疗第3年以后临床耐药例数逐渐增加,8年内共13例患者发生临床耐药。按Kaplan-Meier生存分析方法计算,59例患者ETV治疗7~8年的累积耐药发生率为20.5%。
     2.3 HBV RT序列突变检测
     第1次HBV RT序列突变检测时间为治疗3.5~4年。6例临床耐药患者中4例(表2例1~4)接受检测,另2例患者自行停药而拒绝检测。第2次检测时间在治疗7~8年,新增7例临床耐药患者中的5例(表2例5~9)和已做过1次检测的例4接受检测;另2例新增患者未进行检测,其中1例联合ADF治疗12个月,HBV DNA测不出,另1例电话随访已自动停药。9例临床耐药患者的HBV RT序列突变检测结果见表2。
     9例中5例检测出LAM耐药位点L180和M204位点的变异,同时存在1~2个ETV耐药位点变异,符合ETV耐药特点;3例仅检出LAM耐药位点突变;1例检出2个ETV耐药位点突变和ADF耐药位点A181T突变。例4在治疗4、7年时进行的2次检测结果完全一致,均检出LAM耐药位点L180M、 M204V和V173L位点突变。仅检出LAM耐药位点变异的3例患者在使用ETV前已经对LAM产生耐药。
     表2 9例ETV临床耐药的慢性乙型肝炎患者HBV RT序列突变检测结果
     Tab 2 Results of detection of HBV RT sequence mutations in 9 chronic hepatitis B patients with exhibiting resistance to entecavir
    
     注ETV:恩替卡韦;LAM:拉米夫定;ADF:阿德福韦酯;L:亮氨酸;M:蛋氨酸;V:缬氨酸;I:异亮氨酸;T:胸腺嘧啶;G:鸟嘌呤;A:丙氨酸;N:天冬酰胺;S:丝氨酸;H:组氨酸;[a]例4在治疗4、7年时进行了2次检测;“-”表示未检测到该位点突变
     表3 13例慢性乙型肝炎患者对ETV临床耐药原因的分析
    
     Tab 3 Analysis of the causes of clinical resistance to entecavir in 13 patients with chronic hepatitis B
     注 ETV:恩替卡韦;LAM:拉米夫定;例10~13未进行HBV RT序列突变检测
     2.4 耐药原因分析
     2.4.1 初治药物和LAM耐药状况 ETV组18例中发生临床耐药者2例(11.1%),LAM-ETV组45例中发生临床耐药者11例(24.4%),2组间耐药发生率差异无统计学意义(P=0.237)。LAM-ETV组11例中6例在LAM耐药的基础上换用ETV;4例使用LAM治疗12~37个月(中位数21个月)后换用 ETV,ETV治疗前LAM耐药状况不详;1例使用LAM治疗未发生耐药但患者自行停药。
     2.4.2 HBV DNA水平 13例耐药患者中8例(61.5%)ETV治疗前HBV DNA>8log10拷贝/ml,11例(84.6%)治疗6个月时HBV DNA仍>3log10拷贝/ml(表3)。2例初治药物为ETV的患者治疗前 HBV DNA均>9log10拷贝/ml,且在治疗6个月时 HBV DNA均>3log10拷贝/ml。其中例12在ETV0.5mg/d治疗96周时HBV DNA仍为4.49log10拷贝/ml;96周后ETV剂量改为1.0mg/d,治疗3年 HBV DNA才下降到<300拷贝/ml,以后时有波动;治疗满7年时HBV DNA开始反弹,7.5年时HBV DNA反弹至7.69log10拷贝/ml,考虑临床耐药,但该例未行HBV RT序列突变检测。
     2.4.3 依从性 13例患者中6例(46.2%)依从性差(表3),因不同原因而中断治疗或经常漏服药物。其中例1为ETV组患者,治疗48周后HBV DNA检测不出,但患者在治疗第3年经常漏服药物,按时服药率仅80%。治疗3.5年时出现HBV DNA反弹,再次服药6个月病毒学无应答,HBV DNA反弹至7.82log10拷贝/ml,HBV RT序列突变检测显示EVT耐药位点A181T、T184S和S202H/I突变。
     2.5 耐药后转归
     13例患者中5例改用ETV 1.0mg/d+ADF10mg/d联合治疗,6例耐药后停药,2例未改变治疗方案。5例改用ETV及ADF联合治疗患者中,1例联合治疗1年后HBV DNA下降至<300拷贝/ml;1例HBV DNA波动在2~3log10拷贝/ml;3例联合治疗6个月以上HBV DNA仍>4log10拷贝/ml。6例停药患者中,1例停药后突发肝功能损害入院,经治疗后好转出院,出院后因经济原因改为LAM100mg/d+ADF10mg/d联合治疗,以后失访;1例停药后肝功能基本正常,第8年因ALT升高开始服用ADF治疗;1例停药时间短于3个月,尚未随访;另外3例患者停药后失访。2例未改变治疗方案的患者继续服用ETV 1.0mg/d,HBV DNA均>5log10拷贝/ml,其中1例ALT正常,另1例ALT波动在200~300U/L。无肝衰竭及死亡病例。
     3 讨论
     本组63例患者中45例(71.4%)初治使用的药物为LAM。这些患者在应用ETV治疗的第1~2年无一例发生耐药,第4~8年有11例(24.4%)发生耐药。这个数据明显低于以往文献中报道的LAM、 ADF或1AT的耐药率[11-18]。这表明ETV是目前在中国上市的核苷(酸)类抗HBV药物中耐药基因屏障最高的药物。
     以往研究认为,HBV RT序列至少发生3个位点的碱基置换,即M204和L180再加上至少1个ETV耐药位点(T184、S202或M250),才能构成有临床意义的ETV耐药[19-21]。本研究中符合这一定义的患者有5例。另外有3例患者仅有LAM耐药位点突变,未检测出T184、S202和(或)M250的碱基置换,但同样出现病毒学反弹,导致EVT治疗失败。这种情况也曾出现在其他作者的研究中[19,22-23],可能与 PCR产物直接测序法对耐药病毒检测的敏感性较低有关。另外,本研究中有1例患者检测出ADF耐药位点突变(A181T)和2个ETV耐药位点突变(T184S和S202H/I),但该患者未曾服用过ADF。目前有研究表明A181T/V位点的碱基置换为耐药的“共享途径”[20],这种突变也有可能发生在ETV耐药的患者中。Inoue等[24]曾报道1例未曾服用 ETV的患者在LAM及ADF联合治疗过程中出现少量ETV耐药位点T184S和S202C变异株。因此,在1种药物耐药后也有可能继发某些罕见的HBV RT序列碱基置换,但病毒的这种变异是否影响其对 ETV的敏感性,目前尚不清楚。
     本研究结果显示LAM-ETV组ETV耐药发生率高于ETV组(24.4%比11.1%),这与国外学者研究的结果[25-28]一致,但2组之间耐药发生率差异无统计学意义。这可能因为耐药组样本量太小以及本研究中LAM-ETV组患者大部分既往应用LAM治疗,在ETV治疗前LAM已经停用至少6个月以上[5,29],这些患者是否对LAM耐药或治疗前是否存在LAM耐药株的情况均不详,而ETV-023研究中服用LAM的部分患者并未发生耐药,因此其耐药率低于国外其他研究的报道[25-28]。
     本研究结果还显示,初治应用LAM未发生耐药的患者换用ETV治疗后也有发生耐药的风险,尤其是治疗初期应答不佳的患者。这可能与LAM治疗过程中,其耐药病毒准种逐渐增多,使病毒对ETV的敏感性降低所致[30-31]。尽管近来有研究显示, ETV治疗48周时部分应答的患者中81%在延长疗程后可达到完全应答,且观察144周无一例发生耐药,认为大多数ETV治疗初期不完全病毒应答的初治患者不需要改变治疗方案[32],但本研究和近年 Kurashige等[28]、Zeuzem等[33]和Keeffe等[34]的研究结果均表明治疗前高病毒载量和治疗初期应答不佳仍是ETV长期治疗发生耐药的危险因素之一。因此,对于初治患者,尤其是治疗前高病毒载量患者,首选耐药屏障较高的ETV可减少耐药的发生。然而,当首选ETV治疗的患者出现治疗初期应答不佳的情况时,也要警惕耐药的发生,必要时应尽量加用其他无交叉耐药位点的药物联合治疗[34]。
     在艾滋病治疗的研究中发现,患者的依从性与蛋白酶抑制剂抗病毒的疗效有关。治疗依从性(按时服药率)≥95%的患者治疗失败率为22%,依从性为80%~94%的患者治疗失败率为61%,依从性<80%的患者治疗失败率达80%[35]。也有研究显示,接受抗病毒治疗的艾滋病患者治疗依从性与病毒耐药有关[36-37]。本研究中发生耐药的13例患者中6例存在治疗依从性问题,提示HBV的耐药机制可能与人获得性免疫缺陷病毒相似,治疗依从性也是耐药发生的原因之一。由此提示临床医务工作者应重视对患者治疗依从性的教育和检查,以提高抗病毒药物的疗效,减少耐药的发生。
     ETV耐药后停药可能导致疾病急性加重,应该改变治疗方案继续治疗。根据目前欧美的乙型肝炎治疗指南,ETV耐药后的治疗可选择:(1)加用替诺福韦(tenofovir,TDF)联合治疗[38];(2)换用TDF单药治疗[39];(3)换用TDF和恩曲他滨(emtricitabine)的复合制剂(Truvada)治疗[39]。由于TDF尚未在我国上市,我国《慢性乙型肝炎防治指南》提出在ETV耐药后加用ADF联合治疗[2]。
     综上所述,ETV是一种具有高耐药基因屏障的药物,初治应用ETV患者长期治疗的耐药发生率相对较低。多数ETV耐药患者的HBV RT序列碱基置换符合ETV耐药特点,部分患者仅能检测出LAM耐药位点突变。LAM经治、治疗前高病毒载量、治疗6个月病毒学应答不佳、治疗依从性差可能与ETV耐药的发生有关。初治选择ETV、对治疗初期应答不佳者加强监测、提高治疗依从性可能会减少耐药的发生。
     (收稿日期:2011-11-24)
     (本文编辑:贾艾莎)

 

地址:北京市西城区长椿街45号药物不良反应杂志社 邮编:100053 电话:010-83198246
网站备案:京ICP备13016081号-1
本网站由北京普华和诚科技发展有限责任公司技术支持